爱游戏体育娱乐：重组毕赤酵母发酵产PGA条件优化

  G酰化酶( Penicillin G Acylase，EC 3. 5. 1.11，简称PGA)是用于抗生素中间体6-氨基头孢烷酸(6-APA)和7-氨基脱乙酰头孢烷酸(7-ADCA)生产的重要酶制剂，目前已经在工业中得到了广泛的应用2个方面：一是运用基因工程和蛋白质工程的方法寻找该酶的高产菌株和性能优良菌株；二是探索新的高效的固定化方法，提高酶固定化效率和使用稳定性，改善酶的应用特性。

  巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)有着近年发展起来的一种高效表达外源蛋白的真核系统，其有诸多优点[5]：外源基因稳定、目的蛋白表达量高、分泌效率高、并具有甲醇精确调控的醇氧化酶启动子PAOX及日臻成熟的高密度发酵工艺。如今已用这个系统成功的表达了200种以上蛋白，包括病毒的、细菌的、真菌的、动植物和某些人体蛋白[6]。到目前为止，文献中有关毕赤酵母产胞内PGA的报道较少，笔者采用Box-Behnken实验设计对重组巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行了研究，以期得到高产PGA的发酵条件，从而为PGA工业应用提供实验基础1 材料与方法（MATERIALS AND METHODS）

  YPD液体培养基，BSM基础盐培养基，以及PTM1配方均采用Invitrogen公司提供的标准配方。BSM需高压灭菌后再加4.0 ml/L过滤除菌的PTM1[7]。

  50 mL种子培养基装入250 mL三角瓶中，灭菌冷却后，于无菌状态下吸取0.5~1 mL甘油管菌液，于30℃，220 r/min下，培养40 h。

  将培养好的种子液以10%接种量接种到预装80 mL BSM基础盐生长培养基的500 mL三角瓶中，温度30℃，转速220 r/min下培养，每隔24 h补加甲醇至终浓度1%，每隔12 h补加28%氨水至终浓度0.1%，维持培养基中pH5.5左右，同时亦可补加氮源，培养120 h后，发酵结束。同一水平3组重复实验，以进行统计分析。

  根据单因素实验结果，确定中心组合实验的因素与水平，进行Box-Behnken实验设计和试验结果分析，最终确定重组毕赤酵母发酵产PGA培养的最佳条件。

  在其它发酵基础培养基成分不变的情况下，甘油按30、35、40、45、50 g/L比例加入，诱导培养96 h后，测PGA活力。从图1中能够准确的看出，当甘油质量浓度增高时，菌体产PGA表达水平也随之升高，但当甘油浓度大于40 g/L时，PGA表达水平却随甘油浓度升高而减少，而甘油浓度为40 g/L时重组毕赤酵母PGA表达水平最高，达到8 319 U/L。

  补料用的28%氨水预先经过滤除菌，氨水加入量按体积百分比计算分别为0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%，每隔12 h补加1次。诱导培养96 h后，测PGA活力。从图2中能够准确的看出，随着氨水体积分数增高，PGA酶活也随之升高；当氨水体积分数等于0.1% 时，PGA酶活达到8 296 U/L；而当氨水体积分数大于0.1% 时，PGA酶活却随之下降，说明过高的氨水体积分数不利于毕赤酵母的PGA表达，所以本实验选取每12 h补加28%氨水至0.1%。

  以甲醇浓度分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的诱导培养基重悬菌体进行诱导培养，每24h补加甲醇维持以上浓度。诱导培养96 h后，测PGA活力。甲醇浓度过低，会限制菌体生长和诱导强度；浓度过高，则对菌体产生毒性。从图3中能够准确的看出，最适甲醇浓度为1.0%，PGA表达水平达到8 448 U/L；浓度超过1.5% 时，甲醇对菌体PGA表达水平有抑制作用。

  配制不同pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的诱导培养基，诱导培养96 h后，测PGA活力。pH对菌体生长和诱导表达都会产生一定的影响，从图4中能够准确的看出，最适pH为1.0%，此时的PGA表达水平达到8 402 U/L。

  试验不同的接种量对毕赤酵母表达PGA的影响，接种量大小的控制对很多细胞培养和代谢物积累都起到及其重要的作用[9]。分别以4%、6%、8%、10%、12%的接种量接种到BSM基础盐生长培养基中，结果如图5所示，当接种量为10% 时，此时的PGA表达水平达到8 511 U/L。

  在单因素实验结果的基础上，运用Box-Behnken实验设计考察甲醇体积百分比（X1）、氨水体积百分比（X2）和培养基pH（X3）这3个因素对响应值Y（PGA酶活力）的影响，各个因素的水平和实验结果见表1和表2。

  利用SAS.8.1软件对表2中数据来进行多元回归拟合，二次多项回归方程为：

  对SAS软件拟合所得方程做多元化的分析，该拟合方程方差分析，结果见表3，回归方程系数显著性检验结果见表4。回归方程中各变量由F检验来判定对响应值影响的显著性，其概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表3可知，模型P＜0.01，表明回归模型极显著，其校正决定系数R2Adj=0.947 7，表明仅有总变异的5.23%不能由该模型进行解释。相关系数R2 = 0.981 3以及Lack of Fit值(0.101 80.05)，表明该模型拟合程度良好，实验误差较小，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。

  从表4中能够准确的看出，在实验的水平范围内显著(P＜0.05)的因素为交互项X1X2以及二次项X12 、X22 和X32。对这一现象的可能解释是，毕赤酵母在以甲醇作为诱导物及碳源，合成PGA过程中，需通过呼吸作用产能及相应的还原力NADPH，此过程中释放开来H+部分溶于培养基后pH偏酸；而PGA的合成过程中需要构建酰胺键，随着氨水的补料加入，环境pH会上升，故X1与X2两因素交互作用明显。试验设计过程中，pH跨度为5.0~6.0以及发酵培养基中缓冲液系统的存在，此时培养基中由于细胞的新陈代谢甲醇快速消耗，而酶的合成相对缓慢，所反映出来的是pH与甲醇、氨水补料的相互作用相对较弱。

  进一步优化分析可知，回归方程存在稳定点，且稳定点为极大值。对所得的回归拟合方程进行偏导微分处理得到X1、X2和X3的最佳取值：X1＝0.026、X2＝-0.048、X3＝0.085，即甲醇流加体积比为1.01%、氨水补加体积比为0.10%、培养基pH为5.64，在此条件下表达PGA，回归方程预测的PGA活力为8 701.92U/L。为实验操作便捷，取最优条件为甲醇流加体积比1.0%、氨水补加体积比为0.10%、培养基pH为5.6。

  为检验响应面法所得结果的可靠性，以上述求得的最佳取值下进行重组毕赤酵母PGA表达水平的验证实验，经5次平行实验，实际测得PGA的平均活力为8 680±12U/L，与理论预测值相比误差为0.25%。

  通过单因素试验、Box-Behnken实验设计对重组毕赤酵母产PGA的发酵条件来优化，确定其最佳发酵条件为：甘油浓度40 g/L、氨水浓度0.1%、甲醇浓度1.0%、pH5.6、接种量10%，在此条件下PGA酶活力达到8 680±12U/L。本实验结果对下一步上罐发酵有指导意义，从而为PGA工业应用提供实验基础。

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